簡要描述:糖原磷酸化酶b(GPb)測試盒 糖原磷酸化酶b(Glycogen phosphorylase b,GPb)試劑盒 上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品.為客戶全面解決實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)、開發(fā)需求,提供方便、快捷的服務(wù)。
詳細(xì)介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥 |
糖原磷酸化酶b(GPb)測試盒
微量法 100管/48樣
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶,使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開α-1,4-糖苷鍵移去葡萄糖基,釋放1-磷酸葡萄糖,直至臨近糖原分子α-1,6-糖苷鍵分支點(diǎn)前4個(gè)葡萄糖基處。GP分為有活性的糖原磷酸化酶a(GPa)和無活性的糖原磷酸化酶b(GPb)兩種形式。GPb在一定濃度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。
測定原理:
GP催化糖原和無機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP還原生成NADPH,在340nm下測定NADPH上升速率,即可反映GP活性。添加一定濃度的腺苷酸(5,-AMP)時(shí)測定GP(GPa和GPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)時(shí)測定GPa活性,GP活性-GPa活性得到GPb活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體16 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1支, -20℃保存;
試劑五:粉劑×1支, -20℃保存;
樣本的前處理:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零;
工作液的配制:臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三的配制:臨用前在試劑三瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四的配制:臨用前在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑五的配制:臨用前在試劑五管中加入500μL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于37℃預(yù)熱5分鐘;
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL蒸餾水和160μL工作液,立即混勻,記錄340nm處5min后的A1和10min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔAGPa=A2-A1。
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL試劑五和160μL工作液,立即混勻,記錄340nm處5min后的A3和10min后的吸光值A(chǔ)4,計(jì)算ΔAGP=A4-A3。
注意:由于每個(gè)樣本需要同時(shí)測一個(gè)GP(GPa和GPb)活性和一個(gè)GPa活性,因此本試劑盒100管測48個(gè)樣本。
GPb活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GPb(nmol/min/mg prot)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GPb(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GPb(nmol/min/mg prot)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GPb(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1286×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
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