酸性木聚糖酶測(cè)試盒/酸性半纖維素酶測(cè)試盒

微量法100T/48S

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產(chǎn)生，能催化水解木聚糖，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料中的非淀粉多糖，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，因而廣泛的應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中，ACX一般分離自耐酸的真菌，細(xì)菌及部分霉菌。

測(cè)定原理：

ACX在酸性環(huán)境下能將木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，進(jìn)一步在沸水浴條件下與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng)，在540nm處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過測(cè)定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率，可計(jì)算ACX活力。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋，可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

緩沖液：液體90mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出現(xiàn)白色絮狀或顆粒狀沉淀，可60℃加熱溶解后使用）。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶提取：

1. 發(fā)酵液：發(fā)酵液于8000g，4℃，離心15min，取上清，作為待測(cè)樣品。

2. 酶干粉：稱約0.1mg，加1mL緩沖液溶解待測(cè)。

3. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL緩沖液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定操作表：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至540nm。

2、操作表

ACX計(jì)算公式：

1. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 2.5554x - 0.002 ，R2 = 0.9983

1. 按液體體積活力計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷2.5554÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106

= 435× (ΔA+0.002)

2. 按蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷Cpr

= 435×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr

3. 按鮮重計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷W

= 435×(ΔA +0.002 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；稀釋倍數(shù)=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；

106：轉(zhuǎn)化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.2777x - 0.002 ，R2 = 0.9983

1. 按液體體積活力計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷1.2777÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106

= 869.6× (ΔA+0.002)

2. 按蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷Cpr

= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr

3. 按鮮重計(jì)算：

酶活定義：50℃，pH4.8條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酸性木聚糖酶的活力單位。

ACX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷W

= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；稀釋倍數(shù)=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；

106：轉(zhuǎn)化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)

1. 吸光度變化應(yīng)該控制在0.01～0.8之間，否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2. 試劑盒2-8℃保存，保質(zhì)期3個(gè)月，建議盡快使用。

上海牧榮生物科技有限公司

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